Alle ogen op RNA

12-02-2013

De lijst van RNA-bindende proteïnen gelinkt aan amyotrofische laterale sclerose is groeiende; RNA kan ook verklaren waarom een veelvoorkomende mutatie deze fatale motorneuronaandoening – en een degeneratie – veroorzaakt

In de zomer van 2011 kwam een 3-jaars investigatie door onderzoeksteams op twee continenten in de genetica van amytrofische laterale sclerose (ALS) tot een climax. Dit international consortium had het onderzoek naar een mutatie waarvan ze wisten dat ze ALS veroorzaakte in families vernauwd tot alleen nog 3 genen op chromosoom 9. Tot dan toe had doorgedreven genanalyse, met gebruik van een variëteit aan nieuwe sequentietechnologieën en massieve computerkracht, gefaald om mutaties naar boven te brengen die verantwoordelijk konden zijn.

Wetende dat iets ongewoons op de loer moest liggen in dit DNA-segment wierp Bryan Traynor, een geneticus aan het U.S. National Institute on Aging in Bethesda, Maryland, een nauwere blik op één bijzonder verdacht stuk. Wanneer een computeralgoritme duidelijk faalde in het correct assembleren van de relevante DNA sequenties van aangedane familieleden, schikte Traynor hen manueel. “Ik moest terugkeren naar papyrus en griffel teneinde het in feite uit te werken,” grapt hij.

Op dat moment werd Traynor de eerste persoon om te kijken naar de meest gekende oorzaak van ALS en een ander, licht zeldzamer neurodegeneratieve aandoening genoemd frontotemporale lobaire degeneratie (FTLD). Wat hij zag in het DNA van ALS-patiënten was de nucleotide sequentie GGGGCC die zichzelf almaar weer herhaalde, veel meer dan bij de niet aangedane familieleden. Omdat dit type mutatie geïmpliceerd was bij enkele andere neurodegeneratieve aandoeningen —herhaling van DNA sequenties veroorzaakt bijvoorbeeld Huntington’s aandoening en fragile X syndroom—had Traynor er vertrouwen in dat de langdurende zoektocht van het consortium over was.

Inderdaad, een team geleid door Rosa Rademakers van de Mayo Clinic in Jacksonville, Florida, ontdekte volledig los daarvan dezelfde herhaling in het gen, provisioneel C9ORF72 genoemd, en de twee groepen publiceerden simultaan in Neuron in september 2011. Het werd snel duidelijk dat dit de veruit belangrijkste ALS-gen ontdekking was tot op heden. De C9ORF72 mutatie staat in voor 40% van de familiale ALS en 21% van de familiale FTLD. Het werd ook gevonden bij 7% sporadische ALS, waarbij er geen familiehistorie is van de aandoening—het grote merendeel van de gevallen—en bij 5% van de sporadische FTLD. “Voor het eerst, echt, tonen we aan dat genetica onderliggend kan zijn bij sporadische aandoeningen,” zegt Traynor.

Het hele veld wacht er op uit te vinden hoe de mutatie ALS teweegbrengt—of hoe, bij sommige mensen, ononderscheidbare mutaties in de plaats daarvan FTLD triggeren. ALS ontneemt een persoon zijn controle over de spieren maar spaart de geest, daar waar FTLD juist het omgekeerde doet. (Veel patiënten vertonen symptomen van beide in variabele graden).

De leidende hypothese is dat de lange DNA herhaling een zwellend kwijl voortbrengt dewelke binnen in de cellen een val creëert voor een of meer RNA-bindende proteïnen die nodig zijn voor de werking of het overleven van een zenuwcel. RNA-bindende proteïnen staan onder verdenking in ALS sinds 2006, toen een van hen, TDP-43, ervan blijk gaf in te staan voor de abnormale proteïne afzettingen, gekend als inclusies, die werden gevonden in motorneuronen in bijna alle ALS-gevallen (Science, 6 oktober 2006, p. 42). Mutaties in de genen voor TDP-43 en in FUS, een gerelateerde RNA-bindende proteïne, kan ALS veroorzaken, en mutaties in een derde RNA-bindende proteïne, ataxine-2, zijn een krachtige risicofactor voor de aandoening.

Alhoewel ALS-zenuwcellen aan verschillende types van dysfunctie lijden hebben de multipele recente ontdekkingen geleid tot een “convergentie van gedachten” dat fouten in de RNA-verwerking de kern zijn van ALS en dat zij gelinkt zouden moeten worden aan alle cellulaire problemen, zegt biochemist Don Cleveland van de Universiteit van Californië (UC), San Diego. Anderen in het veld waarschuwen dat ALS in feite meerdere afzonderlijke ziekten zou kunnen omvatten met verschillende oorzaken, waarvan het misverwerken van RNA er maar één is. Niettemin, zegt Cleveland, “sinds vorige september was het de meest opwindende periode aangaande ontdekkingen in ALS in de geschiedenis van deze planeet.”

Binnenwaarts geplooid
Wat RNA-bindende proteïnen doen —of niet doen zoals het geval kan zijn—in ALS en FTLD blijft grotendeels een mysterie. Dat is deels omdat elke proteïne kan binden aan zoveel RNAs, duizenden in sommige gevallen, dat het moeilijk is te weten welke RNAs belangrijk zijn in de aandoening. Naast andere taken knippen, bedekken, vergezellen, degraderen of anders verwerken RNA-bindende proteïnen boodschapper RNA, hetgeen de overgeschreven DNA-sequentie overdraagt vanuit de celkern naar het cytoplasma voor translatie in proteïne. “Er bestaat geen stap in het proces [zonder] een krans van RNA-bindende proteïnen die het RNA omgeven,” zegt Robert Bowser, een neurobioloog aan het Barrow Neurological Institute in Phoenix.

Een sleutelonbekende voor ALS en FTLD onderzoekers is wat RNA-bindende proteïnen triggert om te aggregeren in de inclusies die we zien in de zenuwcellen en andere cellen van het zenuwstelsel van patiënten. Eén hypothese is dat de inclusies voortkomen van stressgranules, dichte ballen van RNA-bindende proteïnen die normaal in cellen verschijnen als reactie op cellulaire stress. Stressgranules vangen normaal RNAs op en voorkomen hun translatie in proteïnen, vermoedelijk om de middelen van de cel te sparen tot de stress over is. “Maar als een consequentie van het hebben van deze belangrijke functie zijn ze gevoeliger aan aggregatie in ziekte op een oncontroleerbare wijze,” zegt geneticus Aaron Gitler van de Stanford Universiteit in Palo Alto, Californië. Normaal lossen stressgranules uiteindelijk op en laten de opgevangen RNA’s los, maar onder persistente stress —of ingevolge genetische risicofactoren—kunnen ze blijven bestaan en omvormen tot massieve cytoplasmatische inclusies in ALS en FTLD.

Genetische evidentie ondersteunt dit idee. In 2010 rapporteerden Gitler, toen aan de Universiteit van Pensylvania (Penn), en medewerker Nancy Bonini dat ongeveer 5% van alle ALS-patiënten mutaties hebben in het gen coderend voor ataxine-2, een RNA-bindende proteïne die betrokken is in de opbouw van stressgranules. Recenter werk suggereert dat gemuteerd ataxine-2 inderdaad bijdraagt aan de vorming van inclusies.

De zes-nucleotide herhalingssequentie in het C9ORF72 gen kan een ander soort aggregaat verwekken—in de celkern, niet in het cytoplasma. Onderzoekers verdenken sterk dat deze DNA sequentieherhaling, die zich bevindt in een niet coderende zone van het gen, een onnatuurlijke RNA structuur doet ontstaan die daar één of enkele RNA-bindende proteïnen opvangt. En het aantal sequentieherhalingen—minstens 30, en dikwijls honderden of zelfs duizenden—zou genoeg proteïne kunnen afscheiden om een zenuwcel te verstoren en zijn afsterven uit te lokken. Inderdaad, Rademakers’s groep documenteerde dat aggregaten RNA foci opvulden in postmortem hersen- en ruggenmergweefsel van C9ORF72 mutatiedragers. “De wedloop is werkelijk open om uit te dokteren welke RNA-bindende proteïne hier afgezonderd wordt,” zegt Gitler.

Er bestaan precedenten voor zulke sekwesters die ziekte veroorzaken. De best gekende is myotonische dystrofie, een volwassen vorm van musculaire dystrofie, waarbij een uitgebreide drie nucleotide sequesterherhaling een RNA-bindende proteïne afscheidt genoemd muscleblind, dewelke betrokken is in RNA splitsing, RNA foci vormend.

Of en hoe RNA foci zenuwcellen beschadigen is niet geweten. En onderzoekers verschillen er van mening over of de cytoplasmatische inclusies in ALS en FTLD zenuwcellen de cellen doden omdat opgeslagen RNA-bindende proteïnen hun normale functie niet kunnen uitoefenen of omdat de aggregaten een nieuwe, toxische functie verwierven. Het antwoord kan beide zijn. “Persoonlijk denk ik dat de beste gegevens dienaangaande aangeven dat zowel het verlies als het verwerven van functie belangrijk zijn,” zegt Gitler.

Ongeïdentificeerde vondsten
Elk definitief besluit, zegt Zissimos Mourelatos, een patholoog aan Penn, moet wachten op identificatie van de RNAs, indien er zijn, die opgeslagen liggen in de inclusies die men ziet in mensen met ALS en FTLD. Zulk werk is onderweg in verscheidene labo’s die een nieuwe techniek gebruiken genoemd CLIP-seq. De techniek gebruikt ultraviolet straling om een chemische binding te doen ontstaan tussen RNA-bindende proteïnen en hun RNAs, uitzuivering van die laatste mogelijk makend en vervolgens hun afzondering en identificatie. In september rapporteerde een groep van UC San Diego in Nature Neuroscience dat ze CLIP-seq gebruikten om RNAs bloot te leggen die gemeenschappelijk zijn in zowel TDP-43 en FUS. Verscheidene van deze RNAs coderen voor proteïnes die belangrijk zijn in synapsvorming en –functie, suggererend dat aggregatie deze synaptische proteïnen uitdunde, neurodegeneratie verwekkend.

TDP-43, FUS, en ataxine-2 zullen niet de enige RNA-bindende proteïnen zijn die betrokken zijn in ALS, voorspellen Gitler en Mourelatos. “Wij denken dat dit het topje van de ijsberg wordt,” zegt Gitler. Inderdaad, in september rapporteerde Bowser’s groep in Acta Neuropathologica het vinden van inclusies die de RNA-bindende proteïne RBM45 bevatte in het cytoplasma van ruggenmergcellen bij 21 van 23 ALS-patiënten, tegenover geen enkele bij zeven controlegevallen. (RBM45-bevattende inclusies waren ook aanwezig in alle zes de geteste FTLD-patiënten.) Geen mutaties in het gen voor RBM45 werden tot nu toe gevonden in ALS, maar dat was ook zo voor TDP-43 toen het voor het eerst werd gevonden in ALS en FTLD inclusies in 2006.

Aan Penn kloonde Gitler’s groep de genen voor bijna 200 RNA-bindende proteïnen en introduceerde hen individueel in gistcellen, controlerende op aggregatie en toxiciteit. Gitler vond tot nu toe mutaties in twee van hen, TAF15 en EWSR1, bij verscheidene mensen met ALS en FTLD, een mogelijke rol bij de aandoening suggererend. “Ik ben er vrij gerust in dat er bijkomende RNA-bindende proteïnen zullen zijn die je spoedig in de literatuur zal zien,” zegt hij.

Wat is er zo special aan zenuwcellen?
Dit alles leidt tot de vraag waarom zenuwcellen zo gevoelig zijn aan veranderingen in RNA-bindende proteïnen, terwijl de meeste andere cellen onaangedaan lijken. “Het is een grote onbekende,” zegt Mourelatos, die suggereert dat de grote hoeveelheid aan gensplitsing die nodig is voor de generatie van proteïne- isoformen en synapsen, het verbindingspunt tussen neuronen, een factor zou kunnen zijn. “Er is veel RNA verwerking bezig in zenuwcellen,” zegt hij. Gitler speculeert dat de gegeven lengte van neuronen—bij mensen kan een enkel zenuwaxon verscheidene halve meters ver strekken—hen meer afhankelijk kan maken van RNA transport en verwerking.

Andere onderzoekers beklemtonen dat, voor ALS op zijn minst, defecten in RNA verwerking niet het hele verhaal zouden kunnen zijn. “Ik denk dat het een veel meer gecompliceerde aandoening is dan dat,” waarschuwt Lucie Bruijn, hoofdwetenschapper aan de ALS Association, met hoofdkwartier in Washington, D.C. Bruijn citeert mitochondriale dysfunctie en defecten in het transport langs motorneuronaxonen als twee belangrijke kenmerken van ALS-aandoeningspathologie. Bijvoorbeeld beschreef een recent verslag in Nature ALS-veroorzakende mutaties in het profiline-1 gen. Profiline-1 beïnvloedt axongroei en reguleert actine, een overvloedige en kritieke proteïne die niet betrokken is bij RNA verwerking. “Het is mij niet duidelijk hoe we die ontdekking kunnen inpassen in een RNA-bindende proteïne wereld,” geeft Cleveland toe. “Dus het is toch een beetje verbazend.”

En een kamp van ALS-onderzoekers houdt het erbij dat het niet RNA misverwerking maar een falen van de proteïne ter beschikkingstelling van de cel is die de aandoening teweegbrengt; mutaties in verscheidene genen betrokken in de proteïneopruiming veroorzaken een klein deel van familiale ALS. De meeste onderzoekers geloven dat een combinatie van RNA misverwerking en falende proteïneopruiming verantwoordelijk is voor de meeste gevallen. “Hoe de twee mekaar tegemoet komen weten we niet,” zegt Traynor.

De actuele intense focus op ziektemechanismen zou nu vergezeld moeten worden van inspanningen om therapieën te ontwikkelen, zelfs voordat deze controverses opgelost zijn, zegt Bruijn. De ALS Association is, naast het bekostigen van muismodellen van de C9ORF72 uitbreiding, ook aan het samenwerken met Isis Pharmaceuticals voor de ontwikkeling van “antisense” DNA geneesmiddelen om de sequentieherhaling te binden en neutraliseren. Alhoewel het ontrafelen van de functie van de mutatie belangrijk is, zegt Bruijn, “kan het dat we het nooit exact weten, of er allemaal over akkoord gaan. En misschien zal er therapeutisch voordeel zijn als we af geraken van die grote uitbreiding.”

–KEN GARBER
Ken Garber is een freelance schrijver met basis in Ann Arbor, Michigan.

 

Vertaling: Hendrik CLARA

Bron: Science