Genetica: de hexanucleotidevloek

25-01-2018

Jarenlang konden onderzoekers de meest gangbare genetische oorzaak van ALS niet vinden, maar nu komt de behandeling ervan in een stroomversnelling.

Door Elie Dolgin

De familie van Mark Price kent een lange traditie van neurologische ziektes. Zijn zuster en oom stierven aan amyotrofische laterale sclerose (ALS) en zijn moeder en tante leden aan dementie. Pas toen hij echter zelf slordig begon te spreken in 2010, kort voor het huwelijk van zijn dochter Sharon, begon het hem te dagen dat er een genetische oorzaak ten grondslag zou kunnen liggen aan het tragische medische verleden van de familie.

Binnen het jaar werd Price gediagnosticeerd met ALS en Sharon vroeg zich af of zijzelf — of haar toekomstige kinderen — de volgende in de rij zouden zijn. "Ik liet mijn plannen even voor wat ze waren en zei tot mezelf: 'Ik kan niet aan kinderen beginnen voor dit helemaal uitgeklaard is'", herinnert Sharon zich, die toen 26 was. In eerste instantie konden de artsen van Price geen tekortkomingen vaststellen in de met ALS geassocieerde genen die toen gekend waren. Dan kwam in september 2011 het bericht dat twee teams van wetenschappers een nieuw gen hadden gevonden dat gekoppeld is aan ALS, een gen dat tot 40% van de familiale gevallen zou kunnen verklaren en 10% van de 'sporadische' gevallen. Meer nog, dit gen was de oorzaak van naar schatting 30% van de erfelijke gevallen van een aandoening die gekend is als frontotemporale degeneratie (FTD). Hierdoor werd eindelijk verklaard waarom deze neurodegeneratieve aandoening vaak leden treft van families die ook te kampen hebben met de motorneuronenziekte ALS — zoals de familie van Price.

Mark Price, Family

Mark Price op een familiefoto met zijn dochters in 1988. In 2011 werd hij gediagnosticeerd met ALS en er werd een gebrekkig C9ORF72-gen bij hem aangetroffen.

De genetische schuldige wordt C9ORF72 genoemd — naar de locatie ervan op chromosoom 9 in een gebied dat gekend is als open leesraam / 'open reading frame' (ORF) 72 en dat een ongewoon nucleotidesequentiepatroon vertoont. Bij sommige mensen met ALS of FTD wordt een kort stukje DNA in een niet-coderend deel van C9ORF72 honderden en zelfs duizenden keren herhaald; bij gezonde individuen wordt dezelfde sequentie — GGGGCC — minder dan twee dozijn keer herhaald.

Begin 2012 werd Price getest op de C9ORF72-herhalingsexpansie. De test was positief en hij stierf een jaar later. En terwijl Sharon en haar twee zussen rouwden om hun vader moesten ze ook het feit onder ogen zien dat ze elk 50% kans maakten drager te zijn van het genetische gebrek. Ze moesten nu beslissen of ze zich zouden laten testen.

Huizenjacht

Het verhaal van C9ORF72 begint met de Duitse psychiater Anton von Braumühl, die in 1932 voor het eerst het verband legde tussen ALS en FTD. Het was echter wachten tot het midden van de jaren 2000, toen de genen werden bestudeerd van meerdere generaties van grote families die werden getroffen door beide aandoeningen, alvorens onderzoekers begonnen in te zoemen op de korte arm van chromosoom 9 als gastheer van het bewuste gen. Tegen 2010 had men het onderzoeksgebied vernauwd tot een streng van 232.000 nucleotides — minuscuul naar genomische standaarden. Geen van de vier genen in dat gebied bevatte echter eiwitwijzigende mutaties die de connectie tussen de ziektes konden verklaren.

"Het is alsof we wisten in welke straat we moesten zoeken, maar het exacte huis niet kenden", zegt Ammar Al-Chalabi, een neuroloog en klinisch geneticus van King's College London.

De jacht op het verantwoordelijke gen was geopend. Ten minste vijf Europese en Noord-Amerikaanse onderzoeksteams gingen op zoek naar een oplossing. Velen dachten dat het van een leien dakje zou lopen, maar C9ORF72 bleek "erg slinks" te zijn, zegt Ekaterina Rogaeva, een moleculair geneticus aan de University of Toronto in Canada. "Het is niet bepaald een gebruiksvriendelijk gebied."

Een groep geleid door Rosa Rademakers, neurogeneticus aan de Mayo Clinic in Jacksonville, Florida, bestudeerde drie generaties van dezelfde familie waarvan tien individuen ALS, FTD of beide hadden. Ze wisten niet precies waarnaar ze moesten zoeken in de genomen van deze patiënten, "dus zochten we naar alles wat verdacht leek", aldus Rademakers. Daartoe behoorde ook het GGGGCC-rijke stukje C9ORF72.

Zij en haar collega's gebruikten polymerasekettingreacties (PKR's) om dat gebied uit te vergroten en ze stelden een ongewoon erfelijk patroon vast: voor elk familielid met een neurodegeneratieve ziekte wees de PKR-test op twee identieke kopieën van C9ORF72 terwijl ze verschillende varianten hadden moeten hebben.

Dat bleek een raadsel voor Rademakers, tot het haar daagde dat de genetische tekortkoming groter was dan de bovenste afmetingslimiet die de PKR kon lezen. Zij en haar medewerkers wendden zich dan ook tot een gevoeliger techniek die herhaalprimer-PKR wordt genoemd en ze observeerden een grote herhalingsexpansie — maar dat enkel bij de getroffen familieleden. Geen van de gezonde familieleden, noch een duizendtal gezonde controlegevallen vertoonden deze herhalingsexpansie.

De onderzoekers testten nog eens 696 mensen met ALS of FTD om er zeker van te zijn dat deze herhaling niet uniek was voor de familie die ze hadden bestudeerd. En wat bleek? Ze vonden de C9ORF72-mutatie bij 59 individuen die geen familie waren, waaronder 22 mensen die geen gekende familiegeschiedenis hadden van neurodegeneratieve ziektes. Verdere experimenten brachten aan het licht dat de GGGGCC-streng zichzelf minstens 700 keer herhaalde.

Rademakers herinnert zich haar opwinding over de ontdekking, die niet zonder gevolgen kon blijven. Op ongeveer hetzelfde moment deed een internationaal consortium onder leiding van Bryan Traynor, een neuroloog en geneticus aan het US National Institute on Aging in Bethesda, Maryland, dezelfde ontdekking. Traynor kreeg de herhalingsexpansie in de gaten door de technische tekortkomingen van een andere DNA-analysemethode — volgendegeneratiesequencing. "Het was opwindend om achter die computer te zitten en te weten wat er echt aan de gang was", zegt hij.

Beide teams publiceerden gelijktijdig hun resultaten in september 2011 in Neuron en waren daarmee andere groepen te vlug af. "Ze waren inderdaad sneller dan wij", zegt Al-Chalabi, "maar daar waren we eigenlijk blij om".

Dankzij in-vitrofertilisatie konden Sharon Stone (links) en Jodie Price, de dochters van Price, vermijden dat ze het gebrekkige gen doorgaven aan hun kinderen. Foto: Sarah Keayes/The Photo Pitch

Spannende tijden

De ontdekking had een onmiddellijke impact. De frequentie van de C9ORF72-stoornis bij patiënten "gaf iedereen die serieus bezig is met ALS het gevoel dat hieraan gewerkt moest worden", zegt Pamela Shaw, een neurologe aan de University of Sheffield in het VK.

Brian Dickie, directeur Onderzoek en Ontwikkeling van de Motor Neurone Disease Association in Northampton, VK, herinnert zich dat hij in de maand september van Londen naar een vergadering in de Verenigde Staten vloog. Dat was vijf dagen na het verschijnen van de verhandelingen van Rademakers en Traynor. Er bevonden zich verscheidene ALS-onderzoekers en -clinici aan boord en één van hen had prints van de manuscripten mee. "Tijdens de vlucht werden ze doorgegeven", zegt Dickie. "Het was erg spannend."

Verscheidene geneesmiddelenfabrikanten waren geïnteresseerd in de ontdekking. "Het was moeilijk om de C9ORF72-ontdekking te negeren", zegt Brian Zambrowicz, hoofd Functionele Genomica van Regeneron Pharmaceuticals, een onderneming in Tarrytown, New York, die werd opgericht om neurodegeneratieve ziektes aan te pakken, maar die 20 jaar geleden haar strategie verbreedde nadat haar eerste kandidaat-geneesmiddel om mensen met ALS te helpen faalde. Volgens Zambrowicz zette de ontdekking van C9ORF72 de onderneming ertoe aan zich opnieuw te richten op ALS-therapieën, met als startpunt de creatie van een C9orf72-muizenmodel.

Ionis Pharmaceuticals, dat gespecialiseerd is in antisense-, op RNA gebaseerde therapieën die ziekteveroorzakende genen kunnen uitschakelen, reageerde eveneens erg snel. "Op de dag dat de verhandelingen verschenen stelden we meteen een plan op", herinnert Frank Bennett zich. Hij is Senior Vicevoorzitter Onderzoek van Ionis, dat zijn hoofdzetel heeft in Carlsbad, Californië. Binnen de twee jaar hadden Bennett en zijn academische medewerkers gedemonstreerd dat een antisensegeneesmiddel de afwijkende-C9ORF72-mRNA-niveaus kon reduceren in celculturen. Iets meer dan twee jaar later hadden ze conceptbewijsgegevens voor muizenmodellen. Een belangrijk kandidaat-geneesmiddel van Ionis wordt nu onderworpen aan preklinische toxicologiestudies en tests op mensen zouden normaliter begin volgend jaar kunnen beginnen.

De snelheid van deze ontwikkelingen, zegt Lucie Bruijn, hoofdwetenschapper van de ALS Association in Washington DC, was deels te danken aan de toevloed van onderzoekers die erop gebrand waren de mechanismen op te sporen waarmee de C9ORF72-storing tot ziekte leidt. De herhalingsexpansie deed denken aan degene die gevonden werden bij andere neurodegeneratieve aandoeningen, waaronder de ziekte van Huntington, myotonische dystrofie and spinocerebellaire ataxie. Bovendien overlapte ze genetisch met FTD. Historisch gezien werkten onderzoekers die deze hersenziektes bestudeerden op zichzelf, maar na de ontdekking van C9ORF72 sloegen ze de handen in elkaar om een gemeenschappelijk doel na te jagen.

"Plots was een groot aantal clinici en wetenschappers geïnteresseerd in ALS", zegt Bruijn. "Dat betekende een enorme opsteker voor dit vakgebied." Het idee dat men zich vormde van de reden waarom de GGGGCC-mutaties mogelijk ALS of FTD veroorzaken had niet zozeer te maken met de herhalingsexpansie, maar meer met het normale C9ORF72-eiwit. Rademakers stelde vast dat de niveaus van het normale eiwit waren afgenomen bij mensen met de genstoornis. Hoewel we nog steeds weinig weten over de rol van het eiwit, is men van mening dat het betrokken is bij het transport van molecules in cellen. De vaststelling van Rademakers leidde tot de suggestie dat lagere niveaus van normaal C9ORF72 de motor zouden kunnen zijn van pathologische hersenreacties.

Initiële studies leken deze hypothese te weerleggen. Muizen met weinig of geen expressie van het C9orf72-eiwit in hun neuronen vertoonden geen gedrag dat kan wijzen op een neurodegeneratieve ziekte, en hun hersenen vertoonden geen typische moleculaire kenmerken van ALS of FTD. Recenter echter hebben verscheidene teams immuuntekortkomingen vastgesteld bij muizen met een gebrek aan C9orf72 in alle weefsels. Alles bij elkaar geven deze bevindingen aan dat de lagere niveaus van werkzaam C9orf72 als dusdanig geen neurondegeneratie veroorzaken, hoewel de veranderde immuunreacties mogelijk de ernst of de voortgang van de ziekte verergeren. "Dit zou een contribuerende factor kunnen zijn", zegt neurowetenschapper Jeroen Pasterkamp van het Universitair Medisch Centrum Utrecht in Nederland, "maar dan wel in combinatie met andere mechanismen".

Werk aan de winkel

Het meest voor de hand liggende alternatieve mechanisme is RNA-toxiciteit. Andere ziektes die worden veroorzaakt door niet-coderende herhalingsexpansies worden verklaard door aggregaten van afwijkend RNA in de kern die zich verbinden met 'huishoudeiwitten', die normaal gezien instaan voor het goede functioneren van de cel maar nu in beslag worden genomen. Voortbouwend op deze hypothese creëerden moleculair neurowetenschapper Adrian Isaacs en zijn collega's aan het University College London transgene fruitvliegen om te testen of deze aggregaten ziekteverwekkend waren. En dat leverde een verrassing op.

Vliegen met meer dan 100 GGGGCC-herhalingen vertoonden wel degelijk tekenen van C9ORF72-gemedieerde neurodegeneratie — maar alleen als het herhalingsbevattende RNA kon worden vertaald naar een eiwit, en niet als het RNA werd verstrengeld met vertalingsstopsignalen. Met andere woorden, RNA-aggregaten waren als dusdanig niet genoeg om een ziekte te verwekken. Malafide eiwitten leken de echte boosdoeners. "Ik was ervan overtuigd dat het om RNA-toxiciteit zou gaan", aldus Isaacs, "maar de gegevens over de vliegen vertelden een ander verhaal".

De eiwitten die voortvloeien uit de GGGGCC-expansie worden aangemaakt via een ongewoon proces waarbij geen startsignaal nodig is en dat zich zelfs kan voordoen bij herhalingssequenties die zich in niet-coderende gengebieden bevinden. Laura Ranum, een neurogeneticus aan het University of Florida College of Medicine in Gainesville, beschreef in 2010 als eerste dit fenomeen, aan de hand van weefsels van mensen met spinocerebellaire ataxie en myotonische dystrofie, en muizenmodellen van deze ziektes.

Volgens Ranum negeerde de onderzoeksgemeenschap haar bevindingen grotendeels. Velen betwijfelden of het mechanisme wel echt was. Toen kwam echter het Symposium over RNA-bindende Eiwitten bij Neurologische Ziektes in november 2011 in Arlington, Virginia, waar Rademakers en Traynor C9ORF72 bespraken en Ranum het had over de ongewone vorm van eiwitvertaling. Het verband was gauw gelegd.

Dieter Edbauer zat in het publiek en luisterde naar Ranum. Hij herinnert zich dat hij zijn laptop erbij nam om te kijken welke soort eiwitten de C9ORF72-expansie kan aanmaken. Omdat de herhaling zes nucleotides lang is — en eiwitsynthese afhangt van een tripletcode — realiseerde Edbauer zich dat C9ORF72 een handvol verschillende eiwitten kan opleveren, die elk twee aminozuren bevatten die steeds weer worden herhaald. Hij typte elk van deze potentiële dipeptideherhalingseiwitten uit. "Ik keek links en rechts van mij om te zien of iemand zag waar ik mee bezig was", herinnert Edbauer zich, die moleculair neurowetenschapper is aan het Duits Centrum voor Neurodegeneratieve Ziektes in München. "Ik dacht dat iedereen met hetzelfde idee zat, maar dat bleek niet zo te zijn."

Vijftien maanden later, in februari 2013, rapporteerden Edbauer en zijn collega's dat deze eiwitten zich opstapelen in het hele brein van mensen die door C9ORF72 zijn aangetast. Al enkele dagen later publiceerden Rademakers en haar collega's aan de Mayo Clinic onder leiding van moleculair neurowetenschapper Leonard Petrucelli gelijkaardige bevindingen. Dat deed ook Ranum nog voor het einde van jaar.

Sindsdien is er een groeiend corpus van bewijsmateriaal voor de stelling dat op zijn minst sommige van de zich herhalende eiwitten "ondubbelzinnig kwaadaardig toxisch" zijn, zegt Paul Taylor, een moleculair geneticus aan het St Jude Children's Research Hospital in Memphis, Tennessee. Het lijkt erop dat deze eiwitten neurodegeneratie veroorzaken door het verkeer van moleculaire cargo's tussen de kern en het cytoplasma in de hersencellen op te stoppen. "De essentiële stoornis in C9ORF72 heeft betrekking op dat nucleair transport", zegt Jeffrey Rothstein, een neuroloog aan de Johns Hopkins University School of Medicine in Baltimore, Maryland.

De schuldige aanwijzen

Sommige onderzoekers zijn nu bereid deze problematische eiwitten als enige schuldige aan te wijzen als het gaat over C9ORF72-gemedieerde ziektes. "Om het zonder omhaal te zeggen: de toxische polydipeptides dragen niet bij tot de ziekte; ze liggen eraan ten grondslag", zegt Steven McKnight, een biochemicus aan het Southwestern Medical Center van de University of Texas in Dallas. McKnight noemt RNA-aggregaten en verlaagde normale C9ORF72-eiwitniveaus "tamelijk onbelangrijk".

De meeste onderzoekers blijven echter twijfelen. "Voor deze eenvoudige modelsystemen is het bewijs dat het eiwit toxisch is overweldigend", zegt says Aaron Gitler, een moleculair neurowetenschapper aan de School of Medicine van de Stanford University in Californië, maar, voegt hij hieraan toe, "in de context van een ziekte bij mensen kan het altijd gaan om een combinatie van factoren en ik moet mijn opties openhouden."

Het debat over het ziektemechanisme is niet louter theoretisch: het stuurt de ontwikkeling van geneesmiddelen. Sommige ondernemingen, waaronder Neurimmune in Zurich, Zwitserland, en Voyager Therapeutics in Cambridge, Massachusetts, spitsen zich louter toe op het blokkeren van de repetitieve eiwitten of proberen te voorkomen dat ze worden aangemaakt, terwijl andere bedrijven, zoals Karyopharm Therapeutics in Newton, Massachusetts, hopen dat ze de tekortkomingen van nucleair transport kunnen afremmen zonder daarbij producten van het C9ORF72-gen rechtstreeks als doelwit te kiezen.

Sommige therapeutische strategieën, zoals antisense, hangen echter niet af van de vraag wat nu precies het mechanisme is. Aangezien antisensegeneesmiddelen de productie van zowel RNA als eiwitten kunnen stilleggen, speelt het geen rol welke daarvan de veroorzakende factor is in de hersencellen, zegt Paul Bolno, CEO van Wave Life Sciences in Cambridge, Massachusetts, dat zich opmaakt om volgend jaar een op C9ORF72 gerichte antisensetherapie op patiënten te testen. En aangezien de niveaus van herhalingseiwitten kunnen worden opgespoord in het ruggenmergvocht, is het eenvoudig te beoordelen of het geneesmiddel werkt of niet. “Je beschikt over een meetbare biomerker", zegt Bolno.

Gezien de snelheid waarmee het onderzoek van de geneesmiddelenfabrikanten vordert, is het perfect mogelijk dat er een effectieve therapie voor C9ORF72-gemedieerde ziektes beschikbaar is op het moment dat de verwanten van Mark Price symptomen van neurodegeneratie beginnen te vertonen. Zijn jongste dochter Haley vindt dat een bemoedigend vooruitzicht. "Hoed af voor de wetenschappelijke gemeenschap", zegt ze. Anderzijds is ze wel bezorgd dat de beleidsmakers onvoldoende doen om de preventieve gezondheidsmaatregelen te ondersteunen die vandaag beschikbaar zijn om C9ORF72-gerelateerde ziektes te voorkomen.

Met het oog op gezinsuitbreiding lieten Haley en haar zusters zich kort nadat hun vader positief was bevonden ook testen op C9ORF72. "Jammer genoeg", zegt Jodie, de oudste zus, "was er voor iedereen slecht nieuws". Sindsdien heeft elke zus verscheidene keren in-vitrofertilisatie laten toepassen. Daarbij lieten ze de embryo's nog voor de implantatie ook checken op de C9ORF72-stoornis. Emotioneel, fysiek en financieel was het voor hen allen een zware dobber. Het kostenplaatje alleen al bedroeg, zo schatten ze, zo'n 100.000 euro. Uiteindelijk was het echter "een bevestiging dat de wetenschap wonderen doet en dat we van deze familievloek konden afraken", zegt Haley.

Sharons zoon Jack vierde onlangs zijn derde verjaardag, Jodie zal midden november bevallen van een dochter en Haley heeft twee bevroren embryo's klaar voor gebruik na haar huwelijk op 9 december.

 

Vertaling: Bart De Becker

Bron: Nature Outlook

Share